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显微镜常见问题

激光共焦显微镜工作原理

来源:  发布时间:2018-11-08   点击量:558

激光共焦显微镜脱离了传统光学显微镜的场光源和局部平面成像模式,采用激光束作光源,激光束经照明针孔,经由分光镜反射至物镜,并聚焦于样品上,对标本焦平面上每一点进行扫描。激光共焦显微镜的主要原理是利用激光扫描束通过光栅针孔形成点光源,在荧光标记标本的焦平面上逐点扫描,采集点的光信号通过探测针孔到达光电倍增管(PMT),再经过信号处理,在计算机监视屏上形成图像。

激光共焦显微镜对于物镜焦平面的焦点处发出的光在针孔处可以得到很好的会聚,可以全部通过针孔被探测器接收。而在焦平面上下位置发出的光在针孔处会产生直径很大的光斑,对比针孔的直径大小,则只有极少部分的光可以透过针孔被探测器接收。而且随着距离物镜焦平面的距离越大,样品所产生的杂散光在针孔处的弥散斑就越大,能透过针孔的能量就越少,因而在探测器上产生的信号就越小,影响也越小。正由于共焦显微仅对样本焦平面成像,有效的避免了衍射光和和散射光的干扰,使得它具有比普通显微镜更高的分辨率,并在生物学中获得了广泛的应用。

组织样品中如果有可被激发的荧光物质,受到激发后发出的荧光经原来入射光路直接反向回到分光镜,通过探测针孔时先聚焦,聚焦后的光被光电倍增管(PMT)探测收集,并将信号输送到计算机,处理后在计算机显示器上显示图像。 在这个光路中,只有在焦平面的光才能穿过探测针孔,焦平面以外区域射来的光线在探测小孔平面是离焦的,不能通过小孔。因此,非观察点的背景呈黑色,反差增加,成像清晰。由于照明针孔与探测针孔相对于物镜焦平面是共轭的,焦平面上的点同时聚焦于照明针孔与探测针孔,焦平面以外的点不会在探测针孔处成像,即共聚焦。以激光作光源并对样品进行扫描,在此过程中两次聚焦,故称为激光扫描共聚焦显微镜。

激光共焦显微镜从产生至今获得了巨大的发展,扫描方式从蕞初的狭缝扫描方式(扫描速度较快,图像分辨率不高),到阶梯式扫描技术(提高了图像分辨率,标本制备要求太高),再到驱动式光束扫描器(扫描速度较快,符合共聚焦原理)。另外,目前激光扫描共聚焦显微镜的光源设计和分光采集技术也有较大的改进,主要集中在如下几个方面:

(1) 现代的工业激光共焦显微镜可以根据研究需要选择不同的激光器。选择激光光源时,一方面要满足研究工作对波长的需求,另一个方面要考虑到激光光源的寿命。

(2)新一代激光扫描共聚焦显微镜可以用棱镜狭缝分光的新技术,配上合适的激光源后,能够摆脱传统的波长滤片组的限制,连续和自由地选择蕞佳波长。

(3)用于激光共焦显微镜的物镜也做了较大的改进,不但具有平场复消色差特性,而且能与高速扫描功能相匹配。


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